在生物制品和細胞治療領域，支原體檢查是保證產品和治療安全的重要一環。生物源性原材料、采用細胞培養技術制備的疫苗、抗體，以及細胞或基因治療產品在生產過程的不同階段都要進行支原體污染的檢查。

傳統支原體檢查方法是培養法和指示細胞培養法，并為藥典所認可和收錄。近年來，『支原體qPCR檢測』在工業領域的應用越來越多，但在項目申報前，先需要進行方法學驗證，依據藥典，在檢測限、特異性和耐用性方面達到要求后，才能替代傳統的檢查方法。

就筆者所知，在適合工業的支原體檢測和方法驗證方面，德國Minerva Biolabs（簡稱MB）公司已有很成熟的產品及商業化應用，它不僅提供有符合藥典的『支原體qPCR檢測』試劑盒，而且有一系列支原體標準品及輔助產品，用于qPCR方法的全面驗證。這些產品性價比也較高，許多客戶都在使用。

下面，筆者就『支原體qPCR檢測』方法驗證的一般要求、德國MB公司提供的『支原體qPCR檢測』的方法驗證產品闡述如下。

 

一、『支原體qPCR檢測』方法驗證的一般要求

各國藥典對支原體核酸擴增檢測方法（簡稱NAT法）的驗證要求略有出入，但均要求對檢出限、特異性和耐用性進行驗證。在檢測方法上，均要求先做樣本的支原體DNA抽提，再進行支原體檢測。

如使用商品化試劑盒，則除了需要試劑盒生產商提供完整的方法學驗證數據外，還需要使用者驗證試劑盒對其樣本的適用性，以及試劑盒表現出預期的性能（例如檢測限、耐用性、是否存在與細菌的交叉反應）。這些必須由使用者自己來證明。

在檢出限驗證中，歐洲藥典（簡稱EP）規定了污染細胞的常見9種支原體，要求NAT如替代培養法，對這9種支原體的檢測限需均達到10CFU/ml。其中如果生產中未采用昆蟲或植物源材料，可不必檢檸檬螺原體（Spiroplasma citri）；如果生產中未使用或暴露于禽源材料，可不必檢關節液支原體（M. synoviae）。

日本藥典（簡稱JP）中的驗證要求與EP基本一致，但在檢出限驗證中，JP 17未提及雞敗血支原體，但增加了唾液支原體的驗證。

終待驗證的支原體物種的選擇，在依據藥典基礎上，還需根據支原體污染風險大小而定。污染風險的影響因素有支原體寄生的宿主細胞的特異性、原材料的來源、產品的應用領域等。

德國MB公司提供有10CFUTM支原體高敏標準品，可同時用于檢測限和耐用性的驗證。

 

關于檢測限和耐用性的檢測次數，有如下公式可參考：

檢測次數 = 支原體物種數 × 3 輪獨立檢測 × 8個復孔/每個物種/每輪

以歐洲藥典規定的9種支原體為例，實際所需檢測次數為9 × 3 × 8 = 216 次檢測。

加上陰性對照、陽性對照、無模板對照以及特異性驗證，預計規格為250次/盒的試劑盒較為適合。

在NAT法的特異性驗證方面，歐洲藥典EP2.6.7指出，梭菌、乳酸桿菌和鏈球菌與支原體具有較近親緣關系，應優先選擇進行驗證。

至于更具體的驗證方案，還需要使用者針對自己的產品以及流程自行設計，德國MB公司也可協助完善。

二、德國MB公司提供的『支原體qPCR檢測』方法的驗證產品

下面列出的方法驗證所需產品，具體有四個表，供使用者參考：

表1.『支原體qPCR檢測』方法驗證所需產品

 

表2. 特異性驗證用標準品

根據EP2.6.7，梭菌、乳酸桿菌和鏈球菌與支原體具有較近親緣關系，適合用于特異性驗證。因此下表列出的是這3個菌屬的產品。用戶也可選擇自己生產過程中可能會遇到的細菌進行特異性驗證。

 

表3. 其他輔助產品

 

表4. qPCR方法驗證所需設備、儀器

 

希望以上信息能給您帶來幫助。

如您對以上產品感興趣，需要訂購或進一步咨詢詳情，請聯系德國MB中國區總代理：北京締一生物科技有限公司。