被廣泛使用的方法

基于Venor®Gem qEP經(jīng)典法試劑盒的qPCR檢測法，目前使用較為廣泛，擁有高特異性、高靈敏度等特點(diǎn)，還可以選配支原體和細(xì)菌DNA、支原體絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品，來進(jìn)行特異性驗(yàn)證、定量檢測。

經(jīng)典法pro版

基于Venor®Gem qOneStep一步法試劑盒的qPCR檢測法，是經(jīng)典法的升級版本，包含經(jīng)典法所有優(yōu)點(diǎn)。另外，內(nèi)控已配置好，更加省時(shí)省力。

傳統(tǒng)認(rèn)為的金標(biāo)準(zhǔn)

分離培養(yǎng)法被認(rèn)為是支原體檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確率比較高，但培養(yǎng)周期長，而且對于一些特定支原體無法培養(yǎng)。

操作步驟多但簡單

DNA染色法檢測支原體雖然操作步驟較多，包含指示細(xì)胞培養(yǎng)，上清液共培養(yǎng)、染色等多個(gè)過程，但并不復(fù)雜，對技術(shù)要求相對沒有那么高。

今天我們就來介紹最后兩種常見檢測法

ELISA法和PCR法

廢話不多說

我們直接上干貨

ELISA法

首先我們先來簡單了解一下ELISA：

酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，簡寫ELISA或ELASA）指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法。根據(jù)免疫吸附劑、酶聯(lián)物、結(jié)合物這些試劑的來源、樣本情況，檢測具體條件，可以分為夾心法、競爭法、間接法等不同類型。

支原體檢測過程中用到的ELISA，一般采用的是夾心法，針對支原體16S rRNA基因的帶標(biāo)記探針或抗體，來檢測培養(yǎng)物中是否含有支原體。

先用純化過的支原體抗體包被微孔板，制成固相抗體。

往微孔板中依次加入支原體（Mycoplasmal），再與 HRP（一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價(jià)結(jié)合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結(jié)合物）標(biāo)記的支原體抗體結(jié)合，形成抗體 -抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物。

經(jīng)過*洗滌后加底物 TMB顯色。TMB在 HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色。

最后用酶標(biāo)儀分析結(jié)果：

顏色的深淺和樣品中的支原體（ Mycoplasmal）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm波長下測定吸光度（ OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中支原體濃度。整個(gè)過程時(shí)間比較短，一般三四個(gè)小時(shí)就能出結(jié)果。

整個(gè)過程除取樣外，還包括標(biāo)準(zhǔn)品稀釋、加樣、溫育、配液、洗滌、加酶、溫育、洗滌、顯色、終止、結(jié)果分析，步驟比較多，且很多步驟都需要有一定經(jīng)驗(yàn)的人操作才能保證準(zhǔn)確性，因此對技術(shù)要求比較高。

另外，由于依賴抗體的特性，該方法能夠檢測的支原體種類比較有限，對于沒有抗體的支原體，ELISA就無能為力了。

PCR法

常規(guī)PCR法：

根據(jù)支原體核糖體16s-23s rRNA的特異保守序列設(shè)計(jì)引物，對待檢樣本DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通過對擴(kuò)增產(chǎn)物的大小分析作出判斷。

以Venor®Gem OneStep支原體常規(guī)PCR檢測試劑盒為例，簡單介紹一下實(shí)驗(yàn)流程。

樣本處理

與qPCR類似

取適量待檢測樣品上清

95℃孵育10min

以對樣品進(jìn)行穩(wěn)定化處理

試劑制備

離心?按比例混合?靜置?混勻

PCR體系建立

設(shè)置好陰性對照、陽性對照、重復(fù)孔

扣緊蓋子混勻

啟動PCR反應(yīng)

根據(jù)使用說明設(shè)置好程序

電泳結(jié)果分析

191bp為內(nèi)控對照條帶，表明PCR反應(yīng)正常。

當(dāng)樣本存在支原體污染時(shí)，由于內(nèi)控對照與支原體DNA存在競爭，內(nèi)控對照條帶變?nèi)酰ɡ缰гwDNA＞1000拷貝）。

陽性對照中支原體DNA＞10000拷貝，內(nèi)控對照條帶會*消失。

可能在80-90bp存在引物自退火形成的條帶，此條帶不影響檢測結(jié)果。

如果待測樣本對PCR產(chǎn)生抑制，則內(nèi)控對照條帶變?nèi)酰ê完幮詫φ障啾龋藭r(shí)應(yīng)先進(jìn)行DNA抽提（推薦使用：Venor® Gem Sample Preparation Kit 支原體DNA抽提試劑盒），然后再檢測。

常規(guī)PCR的優(yōu)點(diǎn)就是檢測時(shí)間短：2-3小時(shí)即可出結(jié)果、靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡單。

缺點(diǎn)也很明顯，用PCR檢測已經(jīng)進(jìn)行過支原體滅活的樣品時(shí)，由于支原體DNA依然存在，所以此時(shí)PCR結(jié)果仍為陽性，說明該樣品曾經(jīng)感染過支原體。

另外不同廠家的試劑盒差異比較大，需要謹(jǐn)慎選擇。

ELISA法

至此，幾種常規(guī)的檢測方法都已經(jīng)介紹給大家啦，給大家做了個(gè)小總結(jié)，供參考。有些單一的檢測方法并不嚴(yán)謹(jǐn)，需要結(jié)合實(shí)驗(yàn)情況，聯(lián)合使用多種方法進(jìn)行檢驗(yàn)，確保結(jié)果的可信度。

培養(yǎng)法是金標(biāo)準(zhǔn)，但是周期長，有些支原體還檢測不到；

染色法普適性強(qiáng)，操作簡單，但是對于支原體數(shù)量有要求，也容易有假陽性假陰性；

ELISA法耗時(shí)短，但是對操作人員要求比較高，需要獲得相應(yīng)抗體才可以進(jìn)行試驗(yàn)；

常規(guī)PCR法，基本包含了上面所有的優(yōu)點(diǎn)，但是不能分辨支原體的死活，用到的試劑盒也是良莠不齊；

qPCR法，涵蓋上述所有優(yōu)點(diǎn)，但是對實(shí)驗(yàn)人員有一定的經(jīng)驗(yàn)要求，因此該方法目前也是十分常用的檢測手段。

不同的是，“一步法"試劑盒中，直接將內(nèi)控添加到預(yù)混液中，使用起來更加方便、節(jié)省時(shí)間。

下面我們就來詳細(xì)介紹一下VenorGeM® OneStep支原體檢測試劑盒。

使用方法

步驟

與經(jīng)典法大致相同：

樣品處理?試劑制備?體系建立?啟動PCR反應(yīng)?結(jié)果判定

樣品處理：

取100μl左右的細(xì)胞上清液

95℃孵育后離心，取適量用于后續(xù)qPCR。

細(xì)胞培養(yǎng)樣品易含豐富的DNA酶，在低溫下也能降解支原體DNA。因而推薦進(jìn)行樣品穩(wěn)定化處理。

試劑制備：

將緩沖液、預(yù)混液、陽性對照等試劑按照說明書要求，該離心的離心、該混合的混合，處理好后扣緊蓋子備用。

PCR體系建立：

在PCR管中，根據(jù)需要，加入樣品、陽性對照、新鮮培養(yǎng)基（陰性對照），并且設(shè)置好重復(fù)孔，蓋好蓋子，震蕩混勻。

啟動PCR反應(yīng)：

按照所需參數(shù)，設(shè)置好PCR儀，啟動程序（具體參數(shù)詳見產(chǎn)品使用說明或是締一生物網(wǎng)站，點(diǎn)擊下方閱讀原文即可）。