《歐洲藥典》第2.6.7章（EP 2.6.7）以及《日本藥典》第G3章（JP G3），詳細(xì)描述了如qPCR等方法、基于核酸擴(kuò)增技術(shù)（NAT）的支原體檢測(cè)。這些藥典中指出，如果需要用NAT法替代傳統(tǒng)方法，要求顯示每毫升樣品體積(CFU/ml)中10個(gè)菌落形成單位的檢測(cè)，即靈敏度達(dá)到10CFU/ml。這種靈敏度驗(yàn)證是方法驗(yàn)證的一條必經(jīng)之路。

然而，由于一些細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室、研究機(jī)構(gòu)、生產(chǎn)線(xiàn)不配備符合支原體培養(yǎng)條件的標(biāo)準(zhǔn)化微生物實(shí)驗(yàn)室，很難實(shí)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)或處理活的、用于靈敏度測(cè)試的支原體菌落。10CFU靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品（不可逆滅活的支原體）便應(yīng)運(yùn)而生。為了保障滅活菌株的使用效果，德國(guó)Minerva Biolabs潛心研制，將先進(jìn)的凍干粉技術(shù)用于支原體檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的生產(chǎn)過(guò)程中，盡可能保障在運(yùn)輸過(guò)程中不破壞其生物活性，能夠幫助科研人員實(shí)現(xiàn)更高靈敏度的檢測(cè)驗(yàn)證。

產(chǎn)品雖好，但也需要配合科學(xué)的使用方法才能事半功倍。本期內(nèi)容，我們就來(lái)一起探討，支原體檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的科學(xué)使用方法。

一、標(biāo)準(zhǔn)品的溫度平衡

標(biāo)準(zhǔn)品在不同溫度下，可能會(huì)表現(xiàn)出不同的特性，忽略溫度平衡可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不穩(wěn)定性。

因此，在復(fù)溶前需對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行溫度平衡處理，以降低因溫度突變引起的損壞或變性的可能性，使標(biāo)準(zhǔn)品溫度逐漸接近溶解時(shí)的溫度，減少溫度變化造成的不良影響，避免基質(zhì)溫度過(guò)低導(dǎo)致凍干粉溶解困難，保證標(biāo)準(zhǔn)品在復(fù)溶過(guò)程的穩(wěn)定性和活性，提高實(shí)驗(yàn)靈敏度。

具體做法是，在復(fù)溶前，需要將標(biāo)準(zhǔn)品從2-8℃環(huán)境中轉(zhuǎn)移至室溫環(huán)境下，對(duì)其進(jìn)行溫度平衡，待所有成分與室溫一致時(shí)，才可進(jìn)行下一步操作。

溫度平衡好后，將標(biāo)準(zhǔn)品放入低速離心機(jī)內(nèi)，短暫離心，通過(guò)旋轉(zhuǎn)，將附著在管壁的凍干粉末甩至瓶底，保障復(fù)溶后物質(zhì)濃度穩(wěn)定。

小心打開(kāi)標(biāo)準(zhǔn)品離心管，沿管壁向每個(gè)離心管中，加入經(jīng)過(guò)室溫平衡的待檢樣品的同款基質(zhì)1ml，室溫孵育5分鐘。不建議用移液器反復(fù)吹打，容易造成試劑的浪費(fèi)。孵育好后，可以漩渦10秒，然后再低速離心機(jī)內(nèi)旋轉(zhuǎn)5秒，將管壁的液體甩下去。

二、支原體標(biāo)準(zhǔn)品DNA提取與擴(kuò)增

滅活支原體含有一部分膽固醇和脂質(zhì)，對(duì)核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)會(huì)造成不同程度的影響。因此，在檢測(cè)前，需要對(duì)支原體標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行DNA提取，以純化標(biāo)準(zhǔn)品中的DNA。并去除可能存在的 PCR 抑制物質(zhì)，從而提高PCR反應(yīng)的靈敏度和特異性。此外，經(jīng)過(guò)提取的支原體DNA更容易被PCR擴(kuò)增，因?yàn)榧兓蟮?span>DNA更容易與引物結(jié)合，并且不易受到來(lái)自樣品基質(zhì)的干擾。推薦使用配套的Venor®GeM Sample Preparation Kit支原體提取試劑盒（貨號(hào)：56-1010）。

根據(jù)提取試劑盒的要求，取適量標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行DNA提取，隨后再進(jìn)行正式的qPCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

三、支原體標(biāo)準(zhǔn)品DNA分裝與儲(chǔ)存

很多實(shí)驗(yàn)人員習(xí)慣將用不完的標(biāo)準(zhǔn)品試劑，在復(fù)溶后進(jìn)行冷藏或冷凍儲(chǔ)存，其實(shí)這樣的操作會(huì)在很大程度上，降低標(biāo)準(zhǔn)品的生物活性，影響檢測(cè)的靈敏度，主要影響因素有以下幾點(diǎn)：

1、降低標(biāo)準(zhǔn)品的生物活性：反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致支原體標(biāo)準(zhǔn)品中核酸等分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或損壞，降低了標(biāo)準(zhǔn)品的活性、影響其穩(wěn)定性。這些變化可能會(huì)在標(biāo)準(zhǔn)品的后續(xù)使用過(guò)程中，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)較大波動(dòng)，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2、污染風(fēng)險(xiǎn)增加：反復(fù)凍融會(huì)增加標(biāo)準(zhǔn)品接觸外界環(huán)境的機(jī)會(huì)，提高了諸如細(xì)菌、真菌等微生物污染，或者其他化學(xué)物質(zhì)的潛在的污染風(fēng)險(xiǎn)。

因此，為了確保支原體標(biāo)準(zhǔn)品的活性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，我們建議，盡量在復(fù)溶后將溶液一次性全部用完，以避免反復(fù)凍融帶來(lái)的潛在負(fù)面影響。

另外需要注意的是，在任何情況下，都不建議將使用前、還未復(fù)溶的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行冷凍保存。

相關(guān)人員的研究顯示，在2-8℃環(huán)境中，德國(guó)MB公司的凍干粉狀態(tài)穩(wěn)定，在有效期內(nèi)保存得當(dāng)?shù)那闆r下均可放心使用，是一種經(jīng)濟(jì)實(shí)惠又穩(wěn)健的儲(chǔ)存方式。

如果將凍干粉置于-20℃環(huán)境下，可能會(huì)使水分重新進(jìn)入粉末中，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)品重新溶解。這個(gè)過(guò)程中，支原體標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)構(gòu)和活性也會(huì)受到影響，從而降低其可靠性和有效性。此外，冷凍過(guò)程中可能會(huì)引起凍融循環(huán)，導(dǎo)致支原體標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性下降，影響其在實(shí)驗(yàn)中的使用效果。